НИПТ

Неинвазивное пренатальное тестирование (НИПТ) осуществляется, чтобы подтвердить или исключить наличие трех хромосом у плода, а именно трисомию 21 (синдром Дауна), трисомию 13 (синдром Патау) и трисомию 18 (синдром Эдвардса).

История НИПТ во всем мире и в Словакии:

1997Открытие свободно циркулирующей ДНК плода
1997Неинвазивное определение пола плода с использованием обнаружения последовательности Y-хромосомы
1998Количественный анализ свободной ДНК плода в материнской кровеносной системе
1998Неинвазивное определение резус-фактора плода
1999Доказано быстрое исчезновение свободной ДНК плода после родов
2000Неинвазивное исследование ДНК для выявления моногенных наследственных врожденных дефектов развития (ахондроплазия)
2008Пилотные исследования, сосредоточенные на неинвазивном выявлении фетальной анеуплоидии
2009Первое применение и подтверждение концепции, основанной на возможностях секвенирования нового поколения (NGS) при определении трисомии 21 плода
2010Детальная характеризация многообразия материнской и фетальной фрагментированной ДНК
2010Детальные карты фетального генома получены неинвазивными методами
2011Начало коммерческого использования НИПТ
2012Полноценная последовательность фетального генома получена неинвазивным путем
2015Первое неинвазивное скрининговое исследование ДНК плода на основании проб материнской крови выполнено в Словакии и используется в клинической практике – TRISOMY test.
2017TRISOMY test нашел более широкое применение наряду с его вариантом TRISOMY test +, который предназначен для выявления дополнительных хромосомных аберраций

Принцип

Наш скрининговый тест основан на анализе всей геномной последовательности свободной ДНК плода, изолированной из периферического кровотока беременной женщины. Данные, полученные путем секвенирования с низким покрытием, оцениваются с использованием индивидуального алгоритма вычислений и проверяются в соответствии с процедурой, опубликованной Дианой Бианки с соавт. (2012).*

 

* Бианки Д. В. с соавт. Определение полногеномной фетальной анеуплоидии методом секвенирования ДНК материнской плазмы / Bianchi DW et al. Genome-wide foetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol. 2012 May;119(5):890-901.

Клиническая значимость

Цель высокочувствительного высокоспецифичного скринингового теста TRISOMY – выявление некоторых часто встречающихся типов трисомии плода на ранних стадиях беременности, чтобы минимизировать потребность в  амниоцентезе,* который сопряжен с определенным риском с точки зрения невынашивания плода вследствие взятия пробы амниотической жидкости.

Несмотря на высокую чувствительность и специфичность при определении отслеживаемых типов трисомии, TRISOMY test является скрининговым методом, а не диагностическим обследованием.
На практике это означает, что любой положительный результат TRISOMY test должен быть подтвержден другим методом с инвазивным взятием генетического материала плода (амниотической жидкости или ворсинчатого хориона) и последующим генетическим обследованием полученной пробы (см. список источников).

Отрицательный результат TRISOMY test исключает присутствие трисомии 21, 18 и 13 у плода. Как правило, отрицательный результат теста не требует подтверждения инвазивными методами (см. список источников).

* Бианки Д. В. с соавт. Определение полногеномной фетальной анеуплоидии методом секвенирования ДНК материнской плазмы / Bianchi DW et al. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol. 2012 May; 119 (5):890 – 901.

Направляющий врач

Скрининговый тест TRISOMY test может быть выполнен по назначению специалиста-гинеколога, акушера или клинического генетика.
Скрининговый тест TRISOMY test XY может быть выполнен по назначению специалиста-гинеколога, акушера или клинического генетика.
Скрининговый тест TRISOMY test + может быть выполнен по назначению специалиста по медицинской генетике.

Чувствительность и специфичность

Скрининговые тесты НИПТ в целом характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью. Тесты ДНК плода, выполняемые в разных лабораториях, обычно отличаются некоторыми техническими деталями. Это приводит к отличию по ключевым параметрам НИПТ, а именно:

  • коэффициенту обнаружения плодов с трисомией – коэффициенту обнаружения (КО),
  • коэффициенту ложноположительных результатов – ложноположительному коэффициенту (ЛПК).

Чувствительность НИПТ при определении трисомий 21 и 18 зависит от особенностей лаборатории и применяемых типов тестирования и обычно находится в диапазоне от 90% до 100% при ложноположительном коэффициенте 0,1%.*

Чувствительность НИПТ при определении трисомии 13 ниже (79 – 92%). Возможные ошибки НИПТ могут быть вызваны техническими причинами либо связаны с чрезвычайно низкой долей беременностей с трисомией 13 в нашей популяции. По этим причинам ожидаемый ложноположительный коэффициент составляет менее 0,1%.*

НИПТ – Определение хромосомной
Анеуплоидии – Надежность

ТестСиндром Дауна
КО (n (%))ЛПК (n (%)
Chiu et al., 201186/86 (100)3/146 (2,1)
Ehrich et al., 201139/39 (100)1/410 (0,24)
Palomaki et al., 2011209/212 (98,6)3/1471 (0,20)
Bianchi et al., 201289/90 (98,9)0/410 (0,00)
Sparks et al., 201236/36 (100)1/123 (0,81)
Ashoor et al., 201250/50 (100)0/297 (0,00)
Norton et al., 201281/81 (100)1/2888 (0,03)
Всего590/594 (99,3)9/5745 (0,16)

TRISOMY test
Чувствительность и специфичность

n = 203Чувстви-
тельность
95 % ДИСпеци-
фичность
95 % ДИnP
T21> 99 %90,97-100 %> 99 %97,78-100 %39
T18> 99 %*> 99 %*5
T13> 99 %*> 99 %*2

n – общее количество проб в валидационном исследовании;
nP – количество положительных проб;
CI – доверительный интервал;
* 95 % ДИ не оценено из-за отсутствия проб.

Количество проб без результата для НИПТ: < 5%
Количество проб без результата для TRISOMY test: < 1%

По чувствительности и специфичности TRISOMY test полностью сопоставим с другими методами НИПТ. Результат анализа основан на валидационном исследовании и подтверждается анализом эталонных проб с известным кариотипом.

Все пробы с трисомией 21, 18 и 13, вошедшие в состав выборки, были успешно выявлены методом TRISOMY test.

Уникальная процедура взятия пробы крови

Процесс лабораторной обработки TRISOMY test t включает в себя уникальную процедуру, позволяющую увеличить долю ДНК плода по сравнению с первоначальным состоянием. В ее основе лежит физическое отличие ДНК плода от материнской. Благодаря этой уникальной процедуре обработки проб теста TRISOMY test лаборатория может получить в среднем 16% ДНК плода (доля ДНК плода в опубликованных исследованиях составляет в среднем от 10% до 13%). Что еще более важно, ни одна из проб, обработанных с использованием этой специальной процедуры, не вышла за пределы нижней границы 7,5% ДНК плода, что значительно снижает риск ошибки при тестировании, вызванной низким содержанием фракции ДНК плода в исследуемой пробе.

Применяя наш специальный метод подготовки, анализа и оценки проб, взятых в рамках валидационного исследования у женщин, беременных здоровым плодом, и беременных женщин с выявленной трисомией хромосомы 21 плода, можно статистически оценить ложноположительные и ложноотрицательные результаты в зависимости от доли ДНК плода в материнской крови. Из доступной нам информации мы можем сделать вывод о том, что доля ДНК плода в материнской крови индивидуальна, а пробы с низкой долей ДНК плода (< 4%) обнаружены менее чем у 5% беременных женщин (средняя доля ДНК плода составляет около 14,5%).***

Наше валидационное исследование проводилось на выборке из проб крови 164 беременных женщин, вынашивающих нормальный плод, и 39 беременных женщин с выявленной трисомией 21. В соответствии с его результатами, средняя доля плодной ДНК в пробах, полученных от беременных женщин, чей плод был поражен трисомией 21, составляла 16 % (синяя кривая на графике 1). Если доля плодной ДНК в материнской системе кровообращения именно такова, то вероятность получения неинформативного результата составляет ~1:3 x 1013, а вероятность получения ложноотрицательного результата, т. е. ошибки, ниже 1:9 x 1018.

middlebox_image-pre-lekarov--odborne-informacie--graf1--en

Вероятность получения неинформативного результата выборки с наиболее низкой долей ДНК плода в нашем исследовании на уровне 7,5 % (красная кривая) составляет ~1:15, а вероятность получения ложноотрицательного, т. е. ошибочного, результата менее 1:740.
Анализ проб крови беременных женщин со здоровым плодом (синяя кривая) предполагает, что возможность получения неинформативного результата составляет ~ 1: 161, а ложноотрицательного, т. е. ошибочного, результата – менее 1:30 000.

 

Для того чтобы свести к минимуму риск получения ложноотрицательного или ложноположительного результата при беременности с низкой долей ДНК плода в крови матери, что естественно характеризует нашу выборку, результаты анализа оцениваются с использованием специальной зоны, определяющей неинформативные результаты, – так называемой серой зоны.

На графике 2 эта зона представлена серой заливкой. Если анализируемая проба попадает в эту зону, необходимо сделать анализ повторно. В этом примере требуется взятие еще одной пробы крови в течение 14 дней после предыдущего отбора.

 

middlebox_image-pre-lekarov--odborne-informacie--graf23--en

*** Худекова И., Сахота Д., Хын М. М., Йин И., Ли В. С., Лин Т. И., Ло И. М., Чу Р. В. Фракции фетальной ДНК в материнской плазме при беременности с низким и высоким риском хромосомной анеуплоидии плода / Hudecova I., Sahota D., Heung M. M , Jin Y., Lee W. S., Leung T. Y., Lo Y. M., Chiu R. W. Maternal plasma foetal DNA fractions in pregnancies with low and high risks for foetal chromosomal aneuploidies.
PLoS One. 2014 Feb 28; 9(2):e88484. doi: 10.1371/journal.pone.0088484

Оценка данных с использованием индивидуального алгоритма

Полученные путем анализа последовательности генома свободной ДНК плода данные отдельных НИПТ оцениваются с использованием сложных математических моделей. Наборы данных НИПТ различаются в зависимости от особенностей лаборатории и применяемых процедур. Целью оценки является определение так называемого Z-показателя (график 4).

middlebox_image-pre-lekarov--odborne-informacie--graf4--en

Усовершенствованный индивидуальный алгоритм, который мы используем для оценки данных TRISOMY test, позволяет нам достичь более высокого среднего значения Z-показателя при оценке проб по сравнению с методами расчета, используемыми нашими конкурентами.

Более высокое среднее значение Z-показателя для проб с положительным результатом, достигнутое благодаря использованию нашего совершенствованного алгоритма для оценки TRISOMY test, автоматически означает более точное распределение значений отрицательных и положительных результатов. Вследствие этого сокращается так называемая серая зона (область перекрытия), в которой невозможно определить, является ли результат теста положительным или трицательным.

Искажение результатов

Поскольку TRISOMY test, TRISOMY test XY и TRISOMY test + – это методы скрининга, а не диагностические обследования, возможно получение как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Положительный результат анализа должен быть подтвержден современными методами диагностики, т. е. генетическим обследованием амниотической жидкости.

Отрицательный результат не полностью исключает присутствие исследуемых типов трисомии. Возможны неточности, вызванные такими естественными явлениями, как плацентарный мозаицизм, синдром исчезнувшего близнеца, точечные мутации, инактивация генов; или другими типами генетических или эпигенетических механизмов, а также присутствием посторонней ДНК в материнской крови.

Существует небольшой процент случаев, в которых невозможно получить точный результат НИПТ. Такие тесты считаются безуспешными.**** Ошибка может произойти как по техническим, так и по биологическим причинам. Неправильное взятие пробы крови и неподходящие условия транспортировки являются основными причинами таких ошибок.

Наиболее распространенной биологической причиной ошибки теста является сниженная доля ДНК плода в полученной пробе по отношению к материнской ДНК. Если доля ДНК плода в полученных пробах составляет менее 4%, надежность теста резко падает (график 5). В соответствии с результатами, представленными в опубликованных на настоящий момент исследованиях, появление проб с низкой долей фракции фетальной ДНК колеблется между 1,5-6,1%.

Результаты, полученные путем оценки проб с долей фетальной ДНК ниже 4%, не подлежат интерпретации.

middlebox_image-pre-lekarov--odborne-informacie--graf5--en

*** М. М. Гил, М. С. Кезада, Р. Ревелло, Р. Аколекар, и К. Х. Николаидес. «Анализ бесклеточной ДНК в материнской крови при скрининге на фетальную анеуплоидию: усовершенствованный мета-анализ» / M. M. Gil, M. S. Quezada, R. Revello, R. Akolekar, and K. H. Nicolaides, “Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for foetal aneuploidies: updated meta-analysis,” Ultrasound Obstet. Gynecol. 45 (3),
249–266 (2015).